Americká armáda potvrdzuje, že PCR testy na ebolu na tých istých ľudských vzorkách prinášajú protichodné výsledky.

Zistenia výskumu z Fort Detrick spochybňujú spoľahlivosť testu na detekciu prípadov eboly.

Štúdia súvisiaca s americkou armádou, publikovaná v časopise Scientific Reports v roku 2023 , ukazuje, že výsledky testov RT-PCR na ebolu sa menili v závislosti od toho, ako boli vyvinuté syntetické priméry a sondy testu – pričom tie isté ľudské vzorky boli v jednej konfigurácii PCR na ebolu negatívne a v inej pozitívne.

PCR testy sa v súčasnosti používajú na detekciu prípadov eboly, ktoré vlády následne používajú ako ospravedlnenie pre karantény a iné autoritárske opatrenia na boj proti prepuknutiu nákazy.

Ak však existuje dôvod pochybovať o samotných testoch, potom existuje aj dôvod pochybovať o reakcii vlády na „prípady“, ktoré identifikovala.

Štúdia, ktorú vykonali výskumníci z Lekárskeho výskumného ústavu infekčných chorôb americkej armády (USAMRIID) a čiastočne financovaná Agentúrou pre zníženie obranných hrozieb (DTRA), priamo vyvracia predstavu, že PCR testy na ebolu predstavujú fixný, stabilný alebo samovalidujúci sa diagnostický systém.

Štúdia bola financovaná:

• „Agentúra pre znižovanie obranných hrozieb (DTRA) a Divízia pre dohľad nad zdravím ozbrojených síl (AFHSD), Divízia pre dohľad nad globálnymi novými infekciami (GEIS).“

Podľa článku:

„Porovnanie výkonnosti nového testu s predchádzajúcimi testami s použitím rôznych vzoriek ľudského EBOV potvrdilo zvýšenú citlivosť testu, čo sa prejavilo v nižších hodnotách Cq a viedlo k tomu, že tri vzorky, ktoré mali v pôvodnom teste negatívny výsledok, boli identifikované ako pozitívne.“

Inými slovami, tie isté ľudské vzorky viedli ku protichodným výsledkom testov na ebolu v závislosti od použitej konfigurácie syntetických primerov a sond.

Publikácia opakovane uznáva, že malé odchýlky v sekvencii medzi primermi/sondami testu a zamýšľanou cieľovou sekvenciou významne zmenili výsledky testu na ebolu.

Podľa štúdie:

„Zmeny v sekvencii primeru alebo sondy a cieľovom organizme môžu viesť k zníženej citlivosti, chybám v teste a falošne negatívnym výsledkom.“

Výskumníci zistili, že aj jedna alebo dve nukleotidové odchýlky dramaticky zmenili správanie amplifikácie.

V publikácii sa uvádza:

„Jeden alebo dva nesúlady primerov alebo sond viedli k účinkom od minimálnych až po zníženie citlivosti takmer o dve logaritmické úrovne.“

Štúdia ďalej uvádza:

„Jediný nesúlad medzi primerom a templátom mal len malý vplyv (zmena Cq < 0,5) na citlivosť testu, zatiaľ čo dva nesúlady viedli k významnému vplyvu (zmena Cq > 4,5).“

PCR amplifikácia prebieha exponenciálne, čo znamená, že posun o 4,5 cyklu je významný.

Štúdia konkrétne zistila:

„Reverzný primer v reverznom teste Ebo-TM (G18A) ukázal dva nesúlady v Kikwite a Makone, čo viedlo k významnému zníženiu citlivosti o 4,9 a 4,55 Cq.“

Štúdia tiež uznáva, že predchádzajúce systémy PCR pre Ebolu boli od začiatku založené na neúplných genomických predpokladoch.

V publikácii sa uvádza:

„V tom čase boli testy vyvinuté s využitím obmedzených dostupných genomických informácií.“

Výskumníci uznali, že neskoršie sekvenovanie počas epidémie odhalilo dodatočnú sekvenčnú diverzitu v ebole, čo by mohlo spochybniť tieto skoršie testy.

V publikácii sa uvádza:

„Rýchle sekvenovanie genómu vykonané počas epidémie identifikovalo genomickú diverzitu, ktorá by mohla negatívne ovplyvniť predtým vyvinuté testy.“

Štúdia opakovane varuje, že údajne „neobjavená“ sekvenčná diverzita by mohla viesť k úplnému prehliadaniu vzoriek pozitívnych na ebolu.

Podľa článku:

„To zvyšuje riziko falošne negatívnych výsledkov testov v dôsledku neobjavenej genetickej diverzity.“

Výskumníci potom zmenili pravidlá molekulárneho rozpoznávania samotného testu prepracovaním primerov a sond a zavedením „degenerovaných nukleotidov“ na rozšírenie zhody sekvencií.

Podľa štúdie:

„Prepracovali sme test Ebo-TM tak, aby zohľadňoval všetky v súčasnosti známe varianty EBOV v cieľovej oblasti testu, a to začlenením degenerovaných nukleotidov na zmiernenie vplyvu nezhôd na výkon testu.“

Prepracovaný test bol následne validovaný pomocou počítačom podporovaných sekvenčných databáz.

Podľa publikácie:

„Analýza in silico ukázala, že tento nový test preukázal 100-percentnú zhodu s 99,7 percentami všetkých sekvencií EBOV v GenBank.“

Publikácia tiež uznáva, že prepracovaný test bol založený výlučne na „všetkých známych“ variantoch eboly.

Podľa štúdie:

„Testy inkluzívnosti ukázali, že nový test EBO-TM2 dokázal detegovať všetky známe varianty EBOV.“

Fráza „všetky známe“ je významná, pretože implicitne uznáva, že dodatočná, zatiaľ neobjavená sekvenčná diverzita by mohla v budúcnosti opäť podkopať súčasné testy – rovnako ako novoobjavená sekvenčná diverzita podkopala predchádzajúce testy.

Štúdia tiež naznačuje, že zmiešané populácie sekvencií v rámci samotných vzoriek by mohli zmeniť správanie amplifikácie.

Podľa článku:

„Mohla by malá populácia vírusu v kmeni EBOV-Mayinga obsahovať varianty zachytené primermi G14A a G18A, čo by viedlo k miernemu zlepšeniu účinnosti amplifikácie?“

Rozhodujúce je, že hoci článok predpokladá, že prepracovaný test bol presnejší, štúdia nikdy nezávisle nepreukázala, ktorý výsledok testu bol v skutočnosti správny pre kontroverzné ľudské vzorky.

To znamená, že publikácia nikdy nezávisle neurčila, či bol pôvodný test nesprávny, či bol prepracovaný test nesprávny, alebo či protichodné pozitívne a negatívne výsledky Ebola boli iba artefaktmi meniacich sa predpokladov týkajúcich sa PCR primerov a sond.

Publikácia priamo dokázala:

• Jedna konfigurácia testu priniesla negatívne výsledky.
• Iná konfigurácia testu priniesla pozitívne výsledky.
• a tie isté ľudské vzorky zmenili svoju diagnostickú klasifikáciu v závislosti od toho, ako bol navrhnutý samotný PCR systém.

Táto práca v konečnom dôsledku predstavuje testovanie eboly RT-PCR ako vysoko sekvenčne závislý molekulárny detekčný systém, ktorého výsledky sú významne ovplyvnené:

• vyvíjajúce sa predpoklady o postupnosti,
• neúplné databázy genómov,
• návrh primerov a sond,
• tolerancia voči nesúladom
• a prebiehajúce rozhodnutia týkajúce sa prepracovania testu.

Záver

Práca ukazuje, že výsledky PCR Ebola sa zmenili, keď sa zmenili priméry a sondy testu, že tie isté ľudské vzorky viedli k protichodným pozitívnym a negatívnym klasifikáciám Ebola pri rôznych konfiguráciách testu a že novo objavená sekvenčná diverzita podkopala predchádzajúce systémy PCR Ebola založené na neúplných genomických predpokladoch.

Rozhodujúce je, že štúdia nedokázala v žiadnom bode nezávisle dokázať, ktorý výsledok testu bol v prípade kontroverzných ľudských vzoriek skutočne správny.

Štúdia namiesto toho ukázala, že samotné diagnostické výsledky eboly sa menili v závislosti od toho, ako bol vyvinutý systém PCR.

Štúdia ďalej uznáva, že údajne „neobjavená“ sekvenčná diverzita môže v budúcnosti naďalej podkopávať súčasné testy, rovnako ako novoobjavená sekvenčná diverzita podkopáva predchádzajúce testy.

To znamená, že systémy RT-PCR pre vírus Ebola budú naďalej závisieť od neúplných databáz genómu, vyvíjajúcich sa predpokladov o sekvenciách, meniacich sa návrhov primerov/sond, rozhodnutí týkajúcich sa tolerancie nesúladu a neustáleho redizajnu samotného testu.

Ak tie isté ľudské vzorky môžu pri rôznych konfiguráciách PCR viesť k protichodným výsledkom testov na ebolu – bez možnosti nezávisle určiť, ktorý výsledok bol skutočne správny – potom je spoľahlivosť testov používaných na zaznamenávanie „prípadov“ eboly a na odôvodnenie karantén a iných opatrení na boj proti prepuknutiu nákazy na základe týchto čísel prípadov vážne spochybnená.