Po 20 rokoch reklamy sa vakcína proti HPV teraz prehodnocuje.

Vakcína proti HPV od spoločnosti Merck je od svojho zavedenia v roku 2006 spájaná s úmrtiami, nežiaducimi udalosťami a kontroverziami. Napriek tomu zostáva súčasťou očkovacích kalendárov a naďalej sa intenzívne propaguje. V USA teraz nová pracovná skupina vykonáva komplexné prehodnotenie vakcíny – jej účinnosti, dávkovania, bezpečnosti a dlhodobých účinkov na populáciu.

Poradný výbor pre imunizačné postupy (ACIP) Centra pre kontrolu a prevenciu chorôb (CDC) zvolal novú pracovnú skupinu, ktorá má vykonať komplexné preskúmanie vakcíny – jej účinnosti, dávkovania, bezpečnosti a dlhodobých účinkov na populáciu, informuje organizácia Children’s Health Defense (CHD) (čítaj dole). Pracovnú skupinu povedie Retsef Levi, profesor na Massachusetts Institute of Technology a súčasný člen ACIP, ktorý sa dôsledne zasadzuje za dlhodobejšie monitorovanie bezpečnosti a väčšiu transparentnosť, pokiaľ ide o neistoty vo vede o vakcínach.

Vakcína proti HPV je tiež zahrnutá v našich očkovacích kalendároch.

Povinné čítanie: https://www.dostojneslovensko.online/preco-je-tento-novy-dokument-who-osn-s-cielovym-datumom-do-roku-2030-klucovy-pre-kazdeho-obcana-a-preco-by-mohol-byt-horsi-ako-covid/

Vakcína proti HPV je jednou z najziskovejších liečebných metód pre farmaceutický priemysel. Od svojho zavedenia je však predmetom ostrej kritiky, pretože hneď od začiatku dochádzalo k úmrtiam a vážnym zdravotným problémom.

Pri príležitosti Svetového dňa boja proti rakovine zverejňuje Rakúska vedecká iniciatíva pre zdravie komplexnú analýzu dôkazov o v súčasnosti silne propagovaných vakcínach proti HPV. Podľa reklamy majú chrániť pred rakovinou krčka maternice a inými druhmi rakoviny. Avšak ani 20 rokov po ich schválení stále neexistujú spoľahlivé údaje, ktoré by tento účinok potvrdili. Naopak, podľa tlačovej správy iniciatívy sa opakovane objavujú a naďalej sa objavujú významné správy o závažných vedľajších účinkoch a dokonca aj úmrtiach.

Výrobcovia sa vyhýbajú placebom kontrolovaným štúdiám a zatajujú dôkazy o závažných poškodeniach spôsobených očkovaním a výrazne zvýšenej úmrtnosti medzi zaočkovanými ženami. Následné štúdie opakovane odhaľujú tie isté nedostatky a recenzie zámerne vylučujú nepohodlné štúdie zo svojho celkového hodnotenia. „Financovanie“ z relevantných organizácií prepojených s priemyslom je možným vysvetlením eufemistického jazyka, ktorý sa, žiaľ, nachádza aj v kedysi vedecky podložených Cochraneových recenziách.

Vakcína proti HPV vyžaduje dve dávky pre všetky dievčatá a chlapcov; tri dávky sa odporúčajú pre osoby vo veku 15 rokov a viac (v Rakúsku
podľa Národného inštitútu pre zdravie a sociálnu starostlivosť (NIG) od 30 rokov). Naplnená injekčná striekačka v súčasnosti stojí v Rakúsku niečo vyše 200 eur. S ročným obratom približne 10 miliárd USD v roku 2024 patrí táto vakcína medzi najpredávanejšie lieky na svete.

Niet divu, že si priemysel môže dovoliť posielať platených rečníkov na „školiace podujatia“ a že to dokonca uznáva a propaguje aj lekárska asociácia a ministerstvo zdravotníctva.

Táto analýza dôkazov zahŕňa súčasný stav výskumu a množstvo odkazov na ďalšie štúdium:

Analýza dôkazov o HPV

Tu je úryvok obsahujúci jednu z kľúčových pasáží:

Ochrana pred rakovinou nebola preukázaná

Prevencia rakoviny krčka maternice očkovaním proti HPV zatiaľ nebola preukázaná v rozsiahlych štúdiách, pretože trvanie štúdie bolo príliš krátke a/alebo počet prípadov bol príliš malý. Cieľovými ukazovateľmi štúdie boli primárne zníženie CIN II+ spôsobenej typmi HPV obsiahnutými vo vakcíne (zmiešaný cieľový ukazovateľ od miernych, často reverzibilných zmien buniek až po invazívny karcinóm) a tvorba protilátok po očkovaní (hoci ochranný rozsah titrov protilátok ešte nebol definovaný).

Tvrdenia týkajúce sa zníženia rizika rakoviny krčka maternice vychádzajú predovšetkým z predpokladu, že zníženie CIN II+ vedie aj k zníženiu prípadov rakoviny (pri ktorých by sa však museli brať do úvahy všetky bunkové zmeny spôsobené všetkými typmi HPV) a z modelových štúdií, ako je táto6, kde za predpokladu 100 % celoživotnej účinnosti vakcíny proti typom HPV odvodeným z vakcíny a 90 % globálnej miery zaočkovanosti – zodpovedajúcej cieľu WHO – by bolo možné znížiť globálne prípady rakoviny krčka maternice na 4/100 000. To je však podmienené skríningom HPV u 70 % žien a 90 % mierou liečby prekanceróznych lézií.

Okrem toho existuje množstvo novších štúdií, ktoré majú preukázať pokles prípadov rakoviny, ale majú masívne metodologické nedostatky.

Ak by vakcína proti HPV zabránila rakovine krčka maternice, krajiny s vysokou mierou zaočkovanosti by mali mať výrazne menej nových prípadov. Čísla však ukazujú opak: Nórsko malo na začiatku roka jednu z najvyšších mier zaočkovanosti proti HPV v Európe (viac ako 90 % v roku 2022). Podľa publikácie HPV Fact Shield z roku 2023 bolo zaznamenaných 17,7 nových prípadov rakoviny krčka maternice na 100 000 žien. Porovnanie týchto údajov s vyššie uvedenými údajmi z Nemecka (miera zaočkovanosti v roku 2022: 45 % a iba 8,7 nových prípadov na 100 000 žien) a modelovými výpočtami vyvoláva otázky o účinnosti vakcíny proti HPV.

Po rokoch presadzovania vakcíny proti HPV ako „bezpečnej a účinnej“ sa CDC teraz bližšie zaoberá touto problematikou

Počas uplynulých 20 rokov sa prístup poradcov CDC pre očkovanie k očkovaniu proti HPV riadil trajektóriou rozširovania oprávnenosti, posilňovania miery očkovania a pridávania nových indikácií. Teraz agentúra zvolala novú pracovnú skupinu, aby vakcínu prehodnotila od základov – jej účinnosť, dávkovanie, bezpečnosť a dlhodobý vplyv na populáciu.

od Maryanne Demasi, PhD. 23. januára 2026

Po takmer dvoch desaťročiach v očkovacom kalendári detí prechádza vakcína proti ľudskému papilomavírusu (HPV) formálnym prehodnotením.

Poradný výbor pre imunizačné postupy (ACIP) Centra pre kontrolu a prevenciu chorôb ( CDC ) zvolal novú pracovnú skupinu, ktorá má od základov prehodnotiť vakcínu – jej účinnosť, dávkovanie, bezpečnosť a dlhodobý vplyv na populáciu.

Pracovnú skupinu povedie profesor Retsef Levi z Massachusettského technologického inštitútu, súčasný člen ACIP, ktorý neustále presadzuje dlhšie sledovanie bezpečnosti a väčšiu transparentnosť, pokiaľ ide o neistotu vo vede o vakcínach.

Počas väčšiny uplynulých 20 rokov sa prístup ACIP k očkovaniu proti HPV riadil trajektóriou rozširovania oprávnenosti, posilňovania miery účasti a pridávania nových indikácií.

Po udelení licencie sa základné predpoklady, na ktorých je táto politika založená , len zriedka znovu otvorili.

Zdá sa, že tento prístup sa teraz mení.

Dlho odkladané prehodnotenie

V decembri 2025 CDC aktualizovalo svoju webovú stránku a zverejnilo nové mandáty , v ktorých nariadilo novej pracovnej skupine, aby prehodnotila kumulatívne dôkazy po takmer dvoch desaťročiach používania v reálnom svete.

Očakáva sa, že táto úloha bude čerpať z odborných znalostí z viacerých oblastí vrátane klinickej medicíny, epidemiológie a zdravia obyvateľstva .

Levi uviedol, že preskúmanie vychádza z poznatku, že rakovina krčka maternice zostáva vážnym ochorením a že infekcia HPV je hlavným rizikovým faktorom.

Poznamenal, že „ vakcíny proti HPV spolu so skríningovými programami a vzdelávaním o zodpovednom sexuálnom správaní sú vzájomne prepojené verejné politiky, ktoré sa snažia obmedziť výskyt, prevalenciu a dopad rakoviny krčka maternice.“

Levi tiež poukázal na vlastné politiky a postupy ACIP , ktoré stanovujú, že každá vakcína odporúčaná výborom by mala byť komplexne prehodnotená najmenej každých sedem rokov.

„Preto,“ povedal, „pracovná skupina pre HPV má v úmysle vykonať komplexný prehľad publikovaných a nepublikovaných vedeckých a klinických poznatkov týkajúcich sa súčasných dôkazov a neistôt týkajúcich sa prínosov a rizík vakcíny.“

Dodal, že pracovná skupina v súčasnosti hľadá vysokokvalifikovaných odborníkov s cieľom aplikovať analýzu založenú na dôkazoch a otvorené vyšetrovanie v rámci prípravy na rozsiahlu diskusiu medzi členmi ACIP.

Výmena kmeňa opäť na programe

Podľa mandátu je úlohou pracovnej skupiny skúmať trendy infekcie HPV špecifických typov v priebehu času.

To, čo tieto trendy ukazujú, je predmetom prebiehajúcej diskusie vo vedeckej literatúre.

Pôvodné vakcíny proti HPV boli zamerané na najčastejšie kmene spojené s rakovinou, najmä na HPV-16 a HPV-18, a následné štúdie na úrovni populácie zaznamenali pokles týchto kmeňov zameraných na vakcínu.

Niektoré štúdie však zaznamenali relatívny nárast iných onkogénnych kmeňov HPV, ktoré neboli pokryté pôvodnými vakcínami, čo zvyšuje možnosť, že potlačenie dominantných kmeňov môže umožniť iným zaplniť ekologický priestor.

Napríklad fínska populačná štúdia pozorovala pokles HPV-16 a HPV-18 spolu s nárastom kmeňov, ako sú HPV-52 a HPV-66.

Obavy z neúplného pokrytia kmeňov viedli k vývoju vakcíny Gardasil 9, ktorá rozšírila ochranu zo štyroch na deväť typov HPV.

Širšie pokrytie však nemusí nevyhnutne viesť k lepším výsledkom.

V štúdii sponzorovanej spoločnosťou Merck s viac ako 14 000 ženami vakcína Gardasil 9 neznížila výskyt cervikálnych lézií vysokého stupňa v porovnaní s pôvodnou štvorvalentnou vakcínou – napriek tomu, že bola zameraná na päť ďalších kmeňov.

Stručne povedané, pokrytie väčšieho počtu kmeňov neviedlo k celkovému menšiemu počtu závažných prekanceróz.

Koľko dávok?

V referenčnom rámci sa pracovná skupina ukladá pokynom preskúmať dôkazy o očkovacích schémach proti HPV s menším počtom dávok vrátane toho, ako počet dávok ovplyvňuje účinnosť, trvanie ochrany a dlhodobé výsledky pre populáciu.

Americké federálne zdravotnícke orgány však odvtedy prepracovali očkovací kalendár detí a zredukovali očkovanie proti HPV na jednu bežnú dávku.

Táto zmena prehodnocuje úlohu pracovnej skupiny a kladie väčší dôraz na posúdenie toho, ako dobre existujúce dôkazy platia pre rôzne populácie, vrátane toho, aká je trvalá ochrana a či imunita slabne.

Znovu sa objavujú otázky týkajúce sa bezpečnosti

Najvýraznejšou zmenou je spôsob, akým sa teraz zaobchádza s bezpečnosťou.

V referenčnom rámci sa pracovná skupina zaväzuje dôkladne preskúmať dôkazy o bezpečnosti po uvedení na trh – vrátane hlásení nežiaducich udalostí podľa dávky a načasovania, údajov zo systému hlásenia nežiaducich udalostí vakcín (VAERS) a zistení z klinických skúšok aj observačných štúdií.

Taktiež nariaďujú skupine, aby preskúmala „potenciálnu toxicitu vakcíny proti HPV, adjuvantov a potenciálnych kontaminantov a/alebo nečistôt“.

V mojej správe sa objavila jedna dlhodobá obava, a to, že väčšina predregistračných štúdií používala ako placebo patentovaný hliníkový adjuvans spoločnosti Merck , AAHS, čo obmedzuje schopnosť generovať jasné porovnávacie údaje o bezpečnosti.

Ďalšou nevyriešenou otázkou, ktorú som skúmala, je zvyšková kontaminácia DNA zistená vo vakcíne Gardasil proti HPV .

Regulačné orgány opakovane uviedli, že prítomné úrovne nepredstavujú žiadne riziko, ale tento záver sa vo veľkej miere opiera o teoretické prahové hodnoty a nie o priame štúdie o bezpečnosti pre ľudí.

Doteraz sa v žiadnych klinických štúdiách špecificky netestovala bezpečnosť zvyškovej DNA v týchto produktoch – táto medzera teraz priamo spadá do rozsahu preskúmania pracovnej skupiny.

Toto obnovené zameranie pozornosti prichádza na pozadí súdnych sporov o údajné zranenia súvisiace s vakcínou Gardasil , ktoré zintenzívnili kontrolu nad tým, ako sa posudzovali bezpečnostné signály a ako sa po schválení oznamovali neistoty.

Zváženie výhod a škôd

Vakcína proti HPV je jedinečná v tom, že akýkoľvek očakávaný prínos – zníženie rakoviny krčka maternice – sa očakáva až o desaťročia neskôr. Naopak, ak sa vyskytne závažný nežiaduci účinok, výsledné poškodenie sa prejaví oveľa skôr a môže byť celoživotné.

Táto časová nerovnováha je dôvodom, prečo je teraz pracovná skupina zodpovedná za kompromis medzi prínosom a poškodením pri očkovaní zdravých dospievajúcich.

V nových mandátoch sa uvádza, že práca tejto skupiny môže viesť k „revízii alebo stiahnutiu“ odporúčaní ACIP, ak sa objavia nové dôkazy.

Pre vakcínu, ktorá bola dlho považovaná za nedotknuteľnú, je tento jazyk dôležitý.

S takmer 20 rokmi dostupných údajov si ACIP plní svoju chartu a prehodnocuje situáciu – tentoraz s menším počtom predpokladov a oveľa väčším počtom otázok.

Názory a stanoviská vyjadrené v tomto článku sú názormi autorov a nemusia nevyhnutne odrážať názory organizácie Children’s Health Defense.

Vakcína HPV je DNA vakcína!!

Vakcína proti HPV (ako napríklad Gardasil) obsahuje drobné, zvyškové fragmenty rekombinantnej DNA génu HPV L1použité vo výrobnom procese, ktoré sú viazané na hliníkový adjuvans vakcíny. FDA to považuje za očakávané, nie za kontamináciu, a uvádza, že to nepredstavuje žiadne riziko pre očkovaných.

Kľúčové detaily týkajúce sa DNA vo vakcíne proti HPV:

Účel: DNA je súčasťou rekombinantnej technológie používanej na vytvorenie vírusom podobných častíc (VLP), ktoré tvoria vakcínu.
Prítomnosť: Štúdie potvrdili, že malé fragmenty DNA génu L1 použité na vytvorenie VLP sú prítomné, viazané na nanočastice síranu hlinitého hydroxyfosforečnanu (AAHS).
Bezpečnosť a účinnosť: FDA uviedla, že prítomnosť týchto fragmentov DNA je očakávaná a nepredstavuje bezpečnostný problém, pričom tvrdí, že vakcína je bezpečná a účinná.
Imunogenicita: Niektorí výskumníci naznačujú, že prítomnosť tejto DNA v kombinácii s adjuvansom by mohla zosilniť imunitnú odpoveď.
Obavy: Naopak, niektoré nezávislé zdroje, ktoré nepatria k FDA, vyjadrili obavy týkajúce sa prítomnosti týchto fragmentov DNA.

Pokyny na zabezpečenie kvality a neklinické hodnotenie bezpečnosti DNA vakcín

1. januára 2007 | Správa zo stretnutia

DNA vakcíny: úloha v boji proti chorobám 1. marca 2013

Terapeutické DNA vakcíny proti ľudskému papilomavírusu a súvisiacim ochoreniam

https://pmc.ncbi.nlm.nih.gov/articles/PMC6152857

Detekcia DNA génu L1 ľudského papilomavírusu (HPV) pravdepodobne viazanej na časticové hliníkové adjuvans vo vakcíne proti HPV Gardasil®

Detekcia fragmentov DNA génu L1 ľudského papilomavírusu v krvi a slezine po očkovaní vakcínou Gardasil® ^– kazuistika

Abstrakt

Na reamplifikáciu amplikónu hypervariabilnej oblasti DNA génu HPV-16 L1 v posmrtnej krvi a slezinnom tkanive získanom pri pitve predtým zdravého dospievajúceho dievčaťa, ktoré utrpelo náhlu a neočakávanú smrť v spánku 6 mesiacov po 3 intramuskulárnych injekciách štvorvalentnej vakcíny proti HPV Gardasilu ®, bola použitá PCR metóda s rovnakým vnorením. Úplná analýza pitvy neodhalila žiadnu príčinu smrti. DNA génu HPV-16 detegovaná v posmrtných materiáloch bola podobná fragmentom DNA génu HPV-16 vo vakcíne Gardasil ^{® v tom, že oba boli v non-B}^– konformácii, čo vyžadovalo nedegenerované priméry GP6 a MY11 na reamplifikáciu PCR amplikónu pre detekciu a na vytvorenie templátu užitočného pre priame sekvenovanie DNA. Sekvencia vyrezaná z elektroferogramu sekvenovania DNA s volaním báz bola analyzovaná pomocou nástroja BLAST (Basic Local Alignment Search Tool) a sekvencia 45 – 60 báz, ktorá sa plne zhodovala so štandardnou hypervariabilnou oblasťou génu HPV-16 L1 získanou z databázy Národného centra pre biotechnologické informácie, potvrdila správny genotyp pre DNA génu HPV-16 L1. Tieto nahé neproliferujúce fragmenty DNA génu HPV-16 L1 sa zdali byť v makrofágoch krvi a sleziny po smrti a boli chránené pred degradáciou pevnou väzbou na časticový hliníkový adjuvans použitý vo formulácii vakcíny. Význam týchto fragmentov DNA HPV vakcínového pôvodu, ktoré sa nachádzajú v materiáloch po smrti, nie je jasný a vyžaduje si ďalšie skúmanie.

Lee, S. (2012) Detekcia fragmentov DNA génu L1 ľudského papilomavírusu v krvi a slezine po očkovaní vakcínou Gardasil®

^– kazuistika.

Advances in Bioscience and Biotechnology ,

3 , 1214-1224. doi:

10.4236/abb.2012.38148 .

1. ÚVOD

Vírusom podobné častice (VLP) ľudského papilomavírusu (HPV) sú nepravidelne tvarované štruktúry s veľkosťou 30 – 50 nm zložené zo samoskladaných pentamérov proteínu L1 hlavnej kapsidy HPV vyrobených technológiou rekombinantnej DNA [1,2]. Genotypovo špecifické VLP pre HPV-16, -18, -11 a -6 sa používajú ako účinná látka kvadrivalentnej vakcíny proti HPV Gardasil®, ^o ktorej sa preukázalo, že znižuje výskyt cervikálnej intraepiteliálnej neoplázie 2. a 3. stupňa u očkovaných žien [ 3 ] a je schválená ako vakcína proti rakovine krčka maternice [ 4 ]. VLP HPV adsorbované na adjuvans amorfný hydroxyfosfát sulfát hlinitý (AAHS) sú v klinických štúdiách mimoriadne účinné pri vyvolávaní produkcie neutralizačných protilátok proti HPV-16 [5 – 7]. Nedávne odhalenie, že Gardasil® ^obsahuje rekombinantné fragmenty DNA génu HPV L1 [8,9], ktoré sa zdajú byť pevne viazané na nanočastice AAHS [ 9 ], môže ponúknuť pravdepodobné vysvetlenie vysokej imunogenicity Gardasilu® ^, pretože spoločné podanie DNA zložky a proteínovej zložky vakcíny so soľami fosforečnanu hlinitého môže mať výhodu v stimulácii silnej a multivalentnej imunitnej odpovede [ 10 ].

Na druhej strane, odhadovaná miera anafylaxie u mladých žien očkovaných vakcínou Gardasil® ^je tiež vysoká a bola hlásená ako 5 až 20-krát vyššia ako v porovnateľných školských očkovacích programoch, pričom sa pre diagnostickú istotu používa definícia anafylaxie z Brightonu [ 11 ]. V svetovej literatúre bolo zaznamenaných niekoľko prípadov pravdepodobne imunitne podmienených zápalových neurodegeneratívnych porúch postihujúcich centrálny nervový systém, známych ako akútna diseminovaná encefalomyelitída, po injekciách Gardasil® ^{[ 12-18]. Medzi 12 424 hlásenými nežiaducimi udalosťami po očkovaní vakcínou}^Gardasil® od 1. júna 2006 do 31. decembra 2008 bolo 32 úmrtí s priemerným vekom 18 rokov, ktoré zomreli 2 až 405 dní po poslednej injekcii Gardasil® [ ¹⁹ ] . Lekárske záznamy a pitevné správy o 20 z 32 úmrtí boli k dispozícii na preskúmanie a potvrdili, že išlo o 4 nevysvetliteľné úmrtia a 6 úmrtí súvisiacich so srdcom [ 19 ]. Nevykonal sa žiadny výskumný pokus na potvrdenie alebo vylúčenie akejkoľvek súvislosti medzi úmrtím a očkovaním vakcínou Gardasil®, ^{hoci medzi osobami, ktoré dostali vakcínu Gardasil®}^, bol hlásený neúmerný počet prípadov synkopy [ 19 ].

Rodičia predtým zdravej mladej novozélandskej ženy, ktorá utrpela náhlu a neočakávanú smrť v spánku 6 mesiacov po očkovaní vakcínou Gardasil® ^, požiadali o testovanie na prítomnosť DNA génu HPV L1 v postmortálnych vzorkách ich zosnulej dcéry odobratých pri pitve. Niektorí z konzultantov rodičov naznačili, že ak by bola v postmortálnych vzorkách prítomná zvyšková DNA génu HPV L1, o ktorej je známe, že je prítomná vo vakcíne Gardasil® ^[ 8,9], mohla by existovať potenciálna súvislosť medzi zvyškovou DNA HPV a nevysvetliteľnou smrťou ich dcéry. Táto práca opisuje skúsenosti s vývojom metódy na detekciu a validáciu nepatrných množstiev DNA génu HPV-16 L1 v postmortálnej krvi a slezine získaných pri pitve. Údaje uvedené v tejto práci boli extrahované z úplnej správy, ktorá bola predložená koronálnemu súdu vo Wellingtone na verejnom vypočutí konanom 8. – 9. augusta 2012.

Rodičia zosnulého udelili autorovi súhlas so zverejnením údajov uvedených v tejto správe.

2. MATERIÁLY A METÓDY

2.1. Vzorky odobraté po smrti

Osemnásťročná zdravá žena žijúca s rodičmi bola nájdená mŕtva v posteli. Jediné relevantné lieky, ktoré dostala pred smrťou, boli tri injekcie Depo Provera počas štyroch rokov a tri dávky intramuskulárnych injekcií vakcíny proti HPV, Gardasilu ^® , v poslednom roku jej života, pričom posledná dávka očkovania Gardasilom ^® bola podaná šesť mesiacov pred jej úmrtím. V anamnéze nebola hlásená žiadna závislosť od alkoholu ani drog. Podľa dokumentov predložených na vyšetrovaní pacientka krátko po prvej dávke injekcie Gardasilu ^® pociťovala zmeny temperamentu , po druhej injekcii začala mať závraty, pocity mravčenia v rukách, výpadky pamäti a bolesti brucha a vyvinula sa u nej prerušovaná slabosť ruky, častá únava vyžadujúca si denné zdriemnutia, zvýšené pocity mravčenia v rukách spôsobujúce vypadávanie vecí z rúk, zvýšená chuť do jedla bez priberania na váhe, nočné potenie, strata schopnosti používať bežné predmety, prerušovaná bolesť na hrudníku a náhly neočakávaný „rýchly tep“. Kompletná pitva neodhalila žiadne anatomické, histologické, toxikologické, genetické ani mikrobiologické nálezy, ktoré by mohli súvisieť s možnou príčinou smrti.

Na žiadosť rodičov a na príkaz koronárneho súdu pripravil Dr. Donald Love v Laboratóriu molekulárnej genetiky nemocnice v Aucklande vzorky DNA z posmrtnej krvi a slezinného tkaniva zosnulého na testovanie na prítomnosť DNA génu HPV L1. Podľa Dr. Lovea bola na extrakciu DNA z frakcie jadrových buniek nefixovanej krvi a slezinného tkaniva, ktoré boli získané v čase pitvy a skladované pri teplote –80 °C, použitá komerčná krvná súprava Gentra ^® Puregene ^® (Qiagen). Purifikovaná DNA bola nakoniec rozpustená v TE pufri s koncentráciou 0,5 µg DNA na µl, vysušená v plastových skúmavkách pomocou speedvac a odoslaná do autorovho laboratória na analýzu. Na základe druhého vydania príručky Gentra ^® Puregene ^® Handbook (september 2007) je výťažok DNA pri tejto metóde prípravy približne 6 pg DNA na ľudskú diploidnú bunku. Preto 0,5 µg DNA zodpovedalo množstvu DNA extrahovanej z ~80 000 jadrových buniek (500 ng/6 pg). Niekoľko rozdelených vzoriek sušenej DNA je uložených v nemocnici v Aucklande na prípadné budúce vyšetrenie nezávislými laboratóriami na príkaz koronálneho súdu.

2.2. PCR pri nízkej teplote

Tradičná tepelne odolná Taq DNA polymeráza nedokázala z nepatrného množstva cieľovej HPV DNA v postmortálnych materiáloch vygenerovať užitočný nested PCR amplikón, ktorý by sa použil ako templát pre priame sekvenovanie DNA. V dôsledku toho bola pre túto štúdiu zvolená LoTemp® ^PCR s vysoko procesívnym HiFi® ^DNA polymerázovým systémom naprogramovaným v krokoch termocyklovania, ktoré neprekračujú 85 °C. Všeobecná metóda použitá na detekciu DNA génu HPV L1 heminestovanou (nested) LoTemp® ^PCR amplifikáciou s degenerovanými konsenzuálnymi primermi GP/MY a validáciou s priamym automatizovaným sekvenovaním DNA pre genotypizáciu bola podrobne opísaná inde pre klinické vzorky [20-25] a pre detekciu zvyškových fragmentov HPV DNA vo vakcíne Gardasil® ^[ 9 ] . Každá primárna PCR pozostávala z 1 μl rekonštituovaného roztoku DNA vo vode molekulárnej kvality s obsahom približne 0,5 μg ľudskej DNA, 2 μl vody, 1 μl 10 μM priameho primeru, 1 μl 10 μM reverzného primeru a 20 μl pripravenej hlavnej zmesi LoTemp® ^PCR s DNA polymerázou HiFi® ⁽ www.hifidna.com ) v celkovom objeme 25 μl. Kroky termocyklovania pre systém LoTemp® ^PCR boli naprogramované na počiatočné zahrievanie pri 85 °C počas 10 minút, po ktorom nasledovalo 30 cyklov, každý nastavený na 85 °C počas 30 sekúnd, 40 °C (PCR s nízkou stringenciou) alebo 50 °C (PCR s vysokou stringenciou) počas 30 sekúnd a 65 °C počas 1 minúty. Konečné predĺženie bolo 65 °C počas 10 minút (30-cyklový program Lo-temp). Jeden μl každej rekonštituovanej vzorky sa umiestnil do samostatnej PCR skúmavky s párom β-globínových primerov na amplifikáciu ľudskej genomickej DNA, aby sa zabezpečila dostatočnosť vzorky.

2.3. DNA génu HPV-16 L1 detegovaná pomocou Same-Nested PCR

Prenos PCR produktov sa uskutočnil pomocou mikrosklenenej tyčinky, aby sa eliminovala potreba mikropipetovania a zabránilo sa kontaminácii aerosólom [ 25 ]. Zmes pre nested PCR pozostávala z 3 μl vody, 1 μl 10 μM priameho primeru, 1 μl 10 μM reverzného primeru a 20 μl pripravenej zmesi LoTemp® ^PCR s HiFi® ^DNA polymerázou v celkovom objeme 25 μl. Kroky termocyklovania pre nested PCR boli identické s krokmi pre primárnu PCR.

V tomto prípade bola na reamplifikáciu cieľovej oblasti génu HPV L1 v postmortálnych vzorkách zavedená „same-nested“ PCR. Na vykonanie „same-nested“ PCR sa primárna PCR a následná „same-nested“ PCR vykonali s identickým párom PCR primerov alebo sa následná „same-nested“ PCR vykonala s párom rovnakých primerov s niekoľkými novými bázami pridanými na 3′ koniec pre jeden alebo pre oba primery, ktoré boli použité v predchádzajúcej PCR. V dôsledku toho boli všetky produkty „same-nested“ PCR ukončené prvým párom PCR primerov použitých na začatie primárnej PCR. Zistilo sa, že protokol „same-nested“ PCR je nevyhnutný na amplifikáciu fragmentov DNA génu HPV-16 L1 v postmortálnych materiáloch v tomto prípade a fragmentov DNA génu HPV-16 L1 vo vakcíne Gardasil® ^[ 26 ] .

Po dokončení primárnej a nested PCR sa z každej skúmavky pipetou odobral 5 µl alikvotný podiel PCR produktov a zmiešal sa s 2 µl nanášacej kvapaliny na elektroforézu v 2 % agarózovom géli obsahujúcom etídiumbromid. Gél sa skúmal pod UV svetlom na prítomnosť rôznych pásov PCR produktov v agarózovom géli.

2.4. Priame sekvenovanie DNA vnorených PCR amplikónov

Na sekvenovanie DNA sa stopa pozitívneho nested PCR produktu preniesla priamo pomocou sklenenej mikrotyčinky z pozitívnej nested PCR skúmavky do 20 µl objemu reakčnej zmesi na cyklické sekvenovanie pozostávajúcej zo 14,5 µl vody, 3,5 µl 5× pufra, 1 µl BigDye Terminator 1.1 (Applied Biosystems) a 1 µl 10 µM sekvenčného primeru. Po tepelnom cyklovaní podľa odporúčania výrobcu sa reakčná zmes naložila do automatizovaného štvorkapilárneho genetického analyzátora ABI 3130 na sekvenčnú analýzu. Analýza zarovnania 45 – 60 bázovej sekvencie v hypervariabilnej oblasti génu L1 vyrezanej z počítačom generovaného elektroferogramu na určovanie báz sa vykonala oproti rôznym štandardným sekvenciám genotypu HPV uloženým v GenBank pomocou online systému BLAST (Basic Local Alignment Search Tool) na validáciu špecifického genotypovania HPV.

2.5. Oligonukleotidy použité ako priméry

Primery pre PCR a sekvenovanie DNA použité a uvedené v tejto správe spolu s ich sekvenciami DNA sú uvedené nižšie.

Priméry degenerovaného HPV L1 génu:

MY09 = 5′-CGTCCMARRGGAWACTGATC-3′

MY11 = 5′-GCMCAGGGWCATAAYAATGG-3′

Kľúč k degenerovaným nukleotidom: M = (A + C), R = (A + G), W = (A + T), Y = (C + T)

Nedegenerované primery génu HPV L1:

GP5 = 5′-TTTGTTACTGTGGTAGATAC-3′

GP6 = 5′-GAAAAAATAAACTGTAAATCA-3′

GP6+ = 5′-GAAAAAATAAACTGTAAATCATATTC- 3′

MY11 (1) = 5′-GCACAGGGACATAACAATGG-3′

MY11 (2) = 5′-GCACAGGGACATAATAATGG-3′

MY11 (3) = 5′-GCACAGGGTCATAACAATGG-3′

MY11 (4) = 5′-GCACAGGGTCATAATAATGG-3′

MY11 (5) = 5′-GCCCAGGGACATAACAATGG-3′

MY11 (6) = 5′-GCCCAGGGACATAATAATGG-3′

MY11 (7) = 5′-GCCCAGGGTCATAACAATGG-3′

MY11 (8) = 5′-GCCCAGGGTCATAATAATGG-3′

HPV16MY11+ = 5′-GCACAGGGCCACAATAATGGCAT-3′

Výber vhodnej kombinácie PCR primerov v rôznych štádiách bol kľúčový pre vytvorenie relatívne čistej templátovej vzorky použiteľnej pre priame sekvenovanie DNA. Predĺženie PCR primeru v tomto prípade zvýšilo špecificitu amplifikácie cieľovej DNA na úkor citlivosti. Ako pozitívna kontrola sa použila purifikovaná plazmidová DNA HPV-16 v plnej dĺžke zakúpená od American Type Culture Collection, zriedená na koncentráciu 1 kópie DNA génu HPV-16 L1 na µl v TE pufri. Pri tejto teoretickej koncentrácii by približne 50 % primárnych PCR a 100 % rovnako vnorených PCR vytvorilo PCR amplikón s veľkosťou ~190 bp pri elektroforéze na agarózovom géli, keď sa ako templát použilo 1 µl pozitívnej kontroly HPV-16 a ako rovnako vnorené PCR primery degenerovaný konsenzus 20-bázový pár primerov GP6/MY11.

3. VÝSLEDKY

3.1. Genomická DNA interferovala s reamplifikáciou cieľovej HPV DNA

Na detekciu nepatrných množstiev fragmentov DNA génu HPV L1 v DNA plnej krvi sa na začatie každej primárnej PCR použil 1 µl neriedenej rekonštituovanej vzorky obsahujúcej 0,5 µg ľudskej genomickej DNA. Všeobecný protokol amplifikácie degenerovaných primerov MY09/MY11, po ktorom nasledovala amplifikácia degenerovanej konsenzuálnej heminestovanej PCR GP6/MY11, ktorý sa ukázal ako veľmi úspešný pri detekcii HPV DNA a pri príprave templátov pre priame sekvenovanie DNA na testovanie HPV DNA v klinických vzorkách [ 25 ] a vo vzorkách Gardasil® ^[ 9, 26], generoval početné prekrývajúce sa pásy PCR produktov pri elektroforéze na agarózovom géli, keď sa rovnaký protokol použil na testovanie materiálov z mŕtvych zvierat. Žiadny z týchto PCR produktov sa nedal použiť na priame sekvenovanie DNA. Keď bolo 8 jednotlivých nedegenerovaných primerov MY11, t. j. MY11 (1), MY11 (2), MY11 (3), MY11 (4), MY11 (5), MY11 (6), MY11 (7) alebo MY11 (8), spárovaných s primerom GP6 na vykonanie 8 jednotlivých paralelných PCR s rovnakými hniezdami, bolo pomocou PCR s rovnakými hniezdami vygenerovaných množstvo PCR produktov s rôznymi veľkosťami bp, ako je znázornené gélovou elektroforézou ( obrázok 1 ). Iba jeden z týchto pásov s veľkosťou ~190 bp, ktorý naznačuje možný amplikón HPV DNA, hoci mal slabú intenzitu, bol získaný pomocou PCR s párom primerov MY11 (1)/GP6 ( obrázok 1 , dráha 1). Sekvenovanie DNA tohto produktu PCR s rovnakými hniezdami s použitím nukleotidu GP6 ako sekvenčného primeru ukázalo elektroferogram zmiešaných fragmentov DNA, pravdepodobne zahŕňajúcich sekvenciu DNA génu HPV-16 L1 vizuálnou analýzou ( obrázok 2 ). Heminestovaná PCR s použitím páru primerov MY09/GP5 nevygenerovala pri gélovej elektroforéze amplikón kompatibilný s produktom HPV DNA PCR.

3.2. Druhá PCR s rovnakým vnorením a predĺženým primerom pre amplifikáciu DNA HPV-16 L1

Na vytvorenie amplikónu vhodného na validáciu sekvenovania DNA sa vykonala druhá PCR s rovnakým vnorením s použitím páru primerov HPV16MY11+/GP6 na reamplifikáciu ( obrázok 3 ). Dvojsmerné sekvenovanie vykonané na tomto novom amplikóne PCR s rovnakým vnorením s použitím oligonukleotidu GP6 a HPV16MY11+ ako sekvenčného primera ukázalo typický segment DNA génu HPV-16 L1 (obrázky 4 a 5).

3.3. Koamplifikácia ľudskej genómovej DNA pomocou HPV DNA primerov

Aby sa charakterizovali necieľové PCR produkty, ktoré sú výsledkom amplifikácie PCR s primermi GP6/MY11, bol amplikón znázornený v dráhe 2 na obrázku 1 sekvenovaný z oboch koncov s použitím oligonukleotidu MY11 (2) a GP6 ako sekvenčného primera. Elektroferogramy DNA sekvenovania potvrdili, že amplikón pozorovaný v dráhe 2 na obrázku 1 predstavuje 318 bp sekvenciu ľudskej genómovej DNA ukončenú primerom GP6 a primerom MY11 (obrázky 6 a 7). 20-bázové HPV DNA primery GP6 a MY11 boli zjavne schopné nasadiť sa na viacero miest ľudského genómu s rôznym stupňom komplementárnej zhody báz a boli schopné iniciovať amplifikácie PCR necieľovej DNA v prostredí PCR s rovnakým vnorením.

3.4. Výber nedegenerovaných primerov MY11/GP6 na prípravu templátu pre sekvenovanie DNA

Na základe vyššie uvedených experimentov bola vykonaná PCR s rovnakým vnorením

Obrázok 1. PCR amplifikácia s rovnakými vnorenými vzorkami s jednotlivými nedegenerovanými primermi MY11 párovanými s primerom GP6 na detekciu DNA génu HPV L1 v postmortálnej vzorke krvi. Ide o gélovú elektroforézu zobrazujúcu rôzne produkty PCR s rovnakými vnorenými vzorkami s rôznymi pármi primerov. Primárna PCR aj PCR s rovnakými vnorenými vzorkami sa uskutočnili v objeme 25 µl obsahujúcom 20 µlhlavnej zmesi LoTemp® PCR s DNA polymerázou HiFi®^,¹ µl 10 µM primeru GP6 a 1 µl 10 µM 1 z 8 nedegenerovaných primerov MY11 označených MY11 (1) až MY11 (8) s ich jednotlivými sekvenciami opísanými v časti Materiály a metódy. Pre termocyklovanie bola po počiatočnom zahrievaní počas 10 minút pri teplote 85 °C naprogramovaná 30-cyklová amplifikácia s teplotou 85 °C počas 30 sekúnd, teplotou 50 °C počas 30 sekúnd a teplotou 65 °C počas 1 minúty s finálnym predĺžením pri teplote 65 °C počas 10 minút pre primárnu aj nested PCR. Výsledky ukazujú, že iba pár primerov MY11 (1)/GP6 generoval možný amplikón HPV DNA s veľkosťou ~190 bp v dráhe 1. Po spárovaní GP6 s inými nedegenerovanými primermi MY11 sa vytvorilo množstvo nešpecifických PCR produktov. Poznámka: BD0697/3 = Číslo šarže pridelené nemocnicou v Aucklande. Molekulárne pravítko 100 – 1000 bp vľavo; N = negatívna kontrola vodou; P = plazmidová DNA HPV-16 amplifikovaná párom degenerovaných konsenzusových párov primerov GP6/MY11.

Obrázok 2. Elektroferogram sekvenovania DNA na možnom amplikóne DNA HPV. Použitím GP6 ako sekvenčného primeru, sekvenčný elektroferogram ~190 bp MY11 (1)/GP6 rovnakého nested PCR amplikónu zobrazeného v dráhe 1, obrázok 1 , naznačil fragment DNA génu HPV-16 L1. Koexistujúce interferujúce nešpecifické PCR produkty však zabránili validácii pomocou testu báz.

Obrázok 3. Druhá vnorená PCR na vytvorenie amplikónu pre priame sekvenovanie DNA. Prvý^vnorený PCR produkt zobrazený v dráhe 1, Obrázok 1 , bol ďalej amplifikovaný párom primerov HPV16MY11+ a GP6 v druhej^vnorenej PCR. Táto gélová elektroforéza ukazuje čistý pás HPV amplikónu v dráhe 1. Poznámka: Dráha 1 = 2.^vnorený PCR amplikón s použitím 1.^vnoreného PCR produktu opísaného v dráhe 1, Obrázok 1 ako templátu; N = negatívna vodná kontrola; P = PCR produkt z P kontroly v 1.^vnorenej PCR bol použitý ako templát.

V tomto prípade bol na počiatočnú detekciu fragmentov DNA génu HPV-16 L1 vo všetkých dávkach extrakcie DNA zvolený pár 20-bázových nedegenerovaných primerov MY11 (1)/GP6. Ukázalo sa, že iba približne 1/3 PCR s rovnakým vnorením s týmto protokolom vykazovala pozitívny amplikón DNA génu HPV-16 L1, čo bolo nakoniec potvrdené sekvenovaním DNA. Necieľové fragmenty ľudskej genómovej DNA, ktoré boli koamplifikované v PCR s rovnakým vnorením, sa značne líšili. Napríklad v extrakte DNA zo sleziny, keď boli štyri 1 µl alikvotné podiely rekonštituovanej vzorky DNA použité na paralelný experiment s rovnakou nested PCR, pričom všetky s použitím nedegenerovaného páru primerov MY11 (1)/GP6 na amplifikáciu, a dve z PCR boli cyklované za podmienok nízkej stringencie s teplotou žíhania 40 °C, zatiaľ čo dve za podmienok vysokej stringencie s teplotou žíhania 50 °C, iba jedna z PCR generovala amplikón HPV DNA s objemom ~190 bp. Aj v druhej nested PCR bol prítomný ťažký produkt s objemom ~500 bp, ktorý bol výsledkom koamplifikácie necieľovej DNA v prostredí heminestovanej PCR ( obrázok 8 , dráha 4). Na selektívnu amplifikáciu cieľovej HPV DNA ( obrázok 9 ) pri príprave amplikónu vhodného na sekvenovanie DNA ( obrázok 10 ) s cieľom potvrdiť, že DNA génu HPV-16 L1 bola prítomná aj v tkanive sleziny získanom pri pitve, bola potrebná 3. ^{nested PCR s použitím nedegenerovaného predĺženého páru primerov HPV16MY11+/GP6+.}

4. DISKUSIA

Na detekciu fragmentov DNA génu HPV-16 L1 prítomných v krvi po smrti a v tkanive sleziny získanom pri pitve dospievajúceho dievčaťa, ktoré utrpelo náhlu a neočakávanú smrť v spánku 6 mesiacov po očkovaní vakcínou Gardasil®, bola potrebná PCR s rovnakým vnorením, v ktorej bol použitý jeden identický pár nedegenerovaných primerov vybraných z dobre charakterizovanej degenerovanej konsenzuálnej 20-bázovej skupiny primerov GP6/MY11, v tejto správe označovaných ako primery MY11 (1)/GP6 ^. Keďže vzorky ľudského genómu obsahujú početné fragmenty DNA, ktoré sú v podstate komplementárne k bázovým sekvenciám primerov HPV PCR, ku koamplifikácii necieľových DNA ľudského genómu vždy dochádza v prostredí PCR s rovnakým vnorením, keď sú PCR amplikóny reamplifikované s rovnakým primerom (primermi). Tieto segmenty ľudskej genómovej DNA môžu pôsobiť ako inhibítory PCR viažuce sa na primery, aj keď čiastočne zhodná väzba primerov negeneruje pásy PCR amplikónov viditeľné pri elektroforéze na agarózovom géli. Postup PCR s rovnakým vnorením má za následok zníženie koncentrácie inhibítorov prenesených z pôvodnej vzorky jednoduchým riedením, čím sa výrazne zvyšuje šanca na získanie cieľového DNA amplikónu [ 25 ]. Na selektívne generovanie špecifického 184-bp HPV-16 PCR amplikónu, ktorý sa má použiť ako templát pre priame sekvenovanie DNA, však môže byť potrebná ďalšia PCR s rovnakým vnorením s predĺženým 23-bázovým primerom HPV16MY11+ a predĺženým 25-bázovým primerom HPV16GP6+.

Predĺžené priméry HPV16MY11+/HPV16GP6+ nemožno v tomto prípade použiť na vytvorenie PCR amplikónu priamo z templátu DNA HPV-16 v materiáloch z posmrtných záznamov. Na porovnanie, DNA génu L1 s dĺžkou 184 bp

Obrázok 4. Elektroferogram s volaním báz zo sekvenovania DNA amplikónu HPV PCR s použitím GP6 ako sekvenčného primeru. Druhé^vnorené PCR produkty opísané v dráhe 1 na obrázku 3 boli použité ako templát na sekvenovanie. Posledných 23 báz predstavuje väzbové miesto primeru HPV16MY11+.

Obrázok 5. Elektroferogram s volaním báz zo sekvenovania DNA HPV PCR amplikónu s použitím HPV16MY11+ ako sekvenčného primeru. Druhé^vnorené PCR produkty opísané v dráhe 1 na obrázku 3 boli použité ako templát pre sekvenovanie. Posledných 20 báz predstavuje väzbové miesto pre GP6 primer (podčiarknuté). Zložená obojsmerná 184-bázová sekvencia odvodená z elektroferogramov volajúcich bázy znázornených na obrázkoch 4 a 5 sa 100 % zhoduje so štandardnou DNA génu HPV-16 L1 takto: GCACAGGGCCACAATAATGGCATTTGTTGGGGTAACCAACTATTTGTTACTGTTGTTGATACTACACGCAGTACAAATATGTCATTATGTGCTGCCATATCTACTCAGAAACTACATATAAAAATACTTAACTTTAAGGAGTACCTACGACATGGGGAGGAATATGATTTACAGTTTATTTTTC-3′ (ID lokusu genómu HPV-16 AF125673, poloha 6582-6765, smer 5′-3′, získané z databázy Národného centra pre biotechnologické informácie).

Obrázok 6. Elektroferogram s rozpoznávaním báz pri sekvenovaní DNA necieľového PCR amplikónu s použitím MY11 (2) ako sekvenčného primeru. Ako templát na sekvenovanie bol použitý vnorený PCR amplikón zobrazený v dráhe 2 na obrázku 1. 20 báz väzbového miesta pre GP6 primeru je na konci rovnako ako v sekvencii DNA génu HPV-16 L1 zobrazenej na obrázku 5 .

Templáta v kontrolnej plazmidovej DNA HPV-16 a v DNA HPV-16 izolovanej z klinických cervikovaginálnych cytologických vzoriek je vždy úspešne amplifikovaná 20-bázovým degenerovaným konsenzuálnym párom primerov GP6/MY11 a predĺženým párom primerov HPV16MY11+ /HPV16GP6+ za identických podmienok PCR s rovnakým vnorením. Na rozdiel od génu L1 v plazmidovej DNA HPV-16 a v izolátoch HPV-16 z klinických cervikovaginálnych vzoriek, fragmenty DNA génu HPV-16 L1 nájdené v postmortálnych vzorkách krvi a sleziny nemožno amplifikovať za podmienok PCR s nízkou stringenciou a chýba im užitočné väzbové miesto pre primer MY09 pre PCR amplifikáciu. Tieto odchýlky v charakteristikách PCR amplifikácie naznačujú, že v fragmentoch DNA génu HPV-16 L1 v postmortálnych vzorkách existujú topologické konformačné zmeny. Podobné topologické nekonformačné zmeny B v DNA fragmentoch génu HPV L1 viazaných na častice AAHS vo vakcíne Gardasil® ^boli preukázané pomocou PCR pri nízkej teplote (LoTemp® ⁾ katalyzovanej vysoko procesívnou DNA polymerázou s funkciou korektúry [ 26 ]. Hliník, na rozdiel od iných kovov, je známy tým, že stabilizuje a destabilizuje časti molekuly dsDNA pri rôznych hodnotách pH, spôsobuje vnútrovláknové zosieťovanie a vytvára „nekooperatívny profil topenia“ pre viazanú molekulu.

Obrázok 7. Elektroferogram s volaním báz pri sekvenovaní DNA necieľového PCR amplikónu s použitím GP6 ako sekvenčného primeru. Vnorený PCR amplikón zobrazený v dráhe 2 na obrázku 1 bol použitý ako templát na sekvenovanie. 20 báz väzbového miesta primeru MY11 (2) sa nachádza na konci elektroferogramu, rovnako ako v prípade DNA génu HPV-16 L1 znázornenej na obrázku 4 . Zložená obojsmerná inter-primérová sekvencia odvodená z elektroferogramov volajúcich bázy znázornených na obrázkoch 6 a 7 ukazuje sekvenciu ľudskej genomickej DNA ohraničenú väzbovým miestom pre primér GP6 (podčiarknuté malé písmená) a väzbovým miestom pre primér MY11 (podčiarknuté veľké písmená) nasledovne:
gcactgggacataataatggGTGATGAGGCATGATAAATGCAACCTATTCTCAAATGGTTCTGGTGGAAAAAAAACATATTTTTACACACGCAGAATAATAAAGATAAAACGTTTAAAAAATTTAAATGTGGATAAATGGTTTATGGGTGTTCTGTGTACTATTGCTACTTTCTAAAAGTTAAACATTGTTTCAAAAACATAAGGTTTTTTTCACACTAGAAATTCTTTTATATGCCATTTATATTGTTTACAAAATAATTCCGCCTTATATGTATCATAACTTATAGACTATTTTGTGATTTACAGTTTATATTTC.

Molekula DNA [ 27 ].

Gardasil® je štvorvalentná vakcína, o ktorej je známe, že obsahuje zvyškové rekombinantné fragmenty DNA génu HPV L1 [ ⁸ ] . Ako pomocná látka vakcíny sa očakáva, že v akejkoľvek šarži vakcíny budú prítomné fragmenty DNA génu HPV L1 všetkých štyroch genotypov, konkrétne HPV-16, -18, -11 a -6. Predchádzajúce štúdie však ukázali, že iba DNA génu L1 HPV-11 alebo HPV-18, alebo kombinácia oboch, bola úspešne amplifikovaná dvojicou degenerovaných konsenzuálnych PCR primerov GP6/MY11 [ 9 ] a že na amplifikáciu fragmentov DNA génu HPV-16 L1 naviazaných na nerozpustnú frakciu vakcíny boli potrebné špeciálne modifikované nedegenerované primery GP6/MY11 [ 26 ], čo naznačuje konformačné zmeny, ku ktorým dochádza, keď sa nahá DNA HPV naviaže na adjuvans AAHS počas formulácie vakcíny. Topologické konformačné zmeny vo naviazanej DNA môžu súvisieť s genotypom. Súčasná štúdia ukazuje, že 6 mesiacov po poslednom očkovaní bola detegovaná iba DNA génu HPV-16 L1, čo ďalej naznačuje, že ne-B-konformácia chránila fragmenty DNA génu HPV-16 L1 pred degradáciou rôznymi nukleázami v ľudskom tele. Je známe, že nechránené cudzie fragmenty DNA v konformácii B zavedené do periférnej krvi cicavčieho hostiteľa sa degradujú a eliminujú do 48 hodín [ 28 ].

HPV-16 je vírus, ktorý infikuje iba ľudské mukózne epitelové bunky. DNA HPV-16 sa môže detegovať v plazme pacientov s invazívnym dlaždicobulínovým karcinómom krčka maternice, ktoré obsahujú rovnaký genotyp vírusu, ale nie u kontrolných subjektov bez rakoviny krčka maternice [ 29 ]. Bolo hlásené, že DNA HPV-16 je prítomná v mononukleárnych bunkách periférnej krvi od pediatrických pacientov infikovaných vírusom ľudskej imunodeficiencie (HIV) a dokonca aj od zdravých darcov krvi [ 30 ]. Na rozdiel od fragmentov DNA génu HPV-16 L1, ktoré sa nachádzajú vo vakcíne Gardasil® a v materiáloch z posmrtných záznamov v tomto prípade pitvy, je však ^DNA génu HPV-16 L1 v týchto hlásených klinických vzorkách vždy v konformácii B, ktorá sa ľahko amplifikuje párom degenerovaných alebo konsenzusových PCR primerov z oboch koncov definovaných väzbovými miestami MY09 a MY11 [ 30 ].

Fragmenty DNA génu HPV-16 L1 detegované v krvi a slezinnom tkanive po smrti sú v tomto prípade pravdepodobne v nepatrných množstvách a v jadrových bunkách, pravdepodobne v makrofágoch. Nahé fragmenty vírusovej a bakteriálnej DNA pevne viazané na nerozpustné soli hliníka môžu byť prenesené do tkanivových makrofágov prostredníctvom fagocytózy, čím sa iniciuje séria imunitných reakcií súvisiacich s DNA [31-34]. Je známe, že intramuskulárna injekcia voľnej plazmidovej DNA HPV-16 L1 u myší BALB/C bez adjuvans indukuje silnú odpoveď CD8 T buniek [ 35 ], čo naznačuje, že za určitých podmienok môže nereplikujúca sa DNA génu HPV L1 aktivovať imunitný systém. Aby však bola detekovateľná 6 mesiacov po intramuskulárnej injekcii, nahá cudzia DNA v hostiteľovi musí byť v stabilizovanom fyzikálnom stave, buď zostávajúcou viazanou na nanočastice AAHS, alebo integráciou do ľudského genómu prostredníctvom doteraz zle pochopených mechanizmov [36-40].

Prítomnosť fragmentov DNA génu HPV-16 L1 vakcínového pôvodu naznačuje možnú koexistenciu inej sprievodnej mikrobiálnej DNA, ako sú fragmenty DNA plazmidu pGAL110 a kvasinkové bunky, ktoré výrobca používa pri výrobe vakcíny [ 2 ]. Potenciálnym dôsledkom týchto vírusových a mikrobiálnych fragmentov DNA s ich nemetylovanými CpG motívmi v makro-

Obrázok 8. Detekcia DNA génu HPV L1 v postmortálnej vzorke sleziny pomocou druhej amplifikácie PCR s rovnakým vnorením a nedegenerovaným párom primerov HPV16MY11+/GP6. Popis: Boli vykonané štyri paralelné PCR s rovnakým vnorením s párom primerov MY11 (1)/GP6, pričom každá začala s 0,5 µg ľudskej genómovej DNA extrahovanej zo sleziny, dve za podmienok nízkej stringencie s teplotou žíhania 40 °C a dve za podmienok vysokej stringencie s teplotou žíhania 50 °C. V prvých PCR s rovnakým vnorením sa nezískal žiadny HPV amplikón^. Potom sa vykonali druhé PCR s rovnakým vnorením, každá s párom primerov HPV16MY-11+/GP6. Ako je znázornené na tejto gélovej elektroforéze, v jednej z dvoch druhých vnorených PCR sa vytvoril intenzívny pás amplikónu HPV DNA s veľkosťou ~190 bp, ktorý je zobrazený v dráhe 4, iba za podmienok vysokej stringencie. Avšak kvôli koamplifikácii ľudskej genomickej DNA, ktorá generovala veľké množstvo PCR produktov s vysokou molekulovou hmotnosťou, nebolo možné použiť tento materiál ako templát pre sekvenovanie DNA.

Účinok fágov [41-46] je vyvolať uvoľňovanie rôznych cytokínov vrátane faktora nekrózy nádorov (TNF), známeho tlmiča myokardu [47-51]. Hypotenzívny šok vyvolaný TNF je zdokumentovaným pozorovaním u zvierat.

Obrázok 9. Tretia PCR amplifikácia s dvoma predĺženými primermi na prípravu templátu DNA HPV-16 zo sleziny DNA na sekvenovanie. Druhé produkty PCR s rovnakým vnorením zo sleziny DNA znázornenej v dráhe 4, obrázok 8 , boli selektívne amplifikované dvojicou primerov HPV16MY-11+ a GP6+, aby sa získal cieľový amplikón HPV-16 na sekvenovanie DNA. Poznámka: M = molekulárne pravítko; 4 = reamplifikácia produktov PCR z dráhy 4 znázornených na obrázku 8 s dvoma predĺženými primermi; N = negatívna kontrola vody; P = kontrola plazmidovej DNA HPV-16.

Obrázok 10. ElektroferogramDNA sekvenovania s rozpoznávaním báz na HPV PCR amplikóne z postmortálnej slezinovej DNA. Ide o typickú sekvenciu DNA génu HPV-16 L1 s použitím GP6+ ako sekvenčného primeru a PCR amplikónu č. 4 opísaného naobrázku 9ako templátu.

[52,53] a ľudia [54,55]. Na zodpovedanie otázky, či množstvo týchto perzistentných vírusových alebo mikrobiálnych fragmentov DNA môže stimulovať makrofágy k uvoľneniu dostatočného množstva TNF na vyvolanie významného patofyziologického účinku po očkovaní vakcínou Gardasil®, ^je potrebný rozšírený výskum.

5. ZÁVER

Detekcia fragmentov DNA génu HPV-16 L1 v ne-B konformácii v postmortálnej krvi a slezine osoby, ktorá zomrela náhle a neočakávane 6 mesiacov po štvorvalentnom očkovaní proti HPV, nebola doteraz hlásená a vyžaduje si ďalšie vyšetrenie.

6. POĎAKOVANIE

Túto štúdiu si objednala a sponzorovala spoločnosť SANE VAX, Inc. s budúcou platbou nepresahujúcou jeden americký dolár. Autor ďakuje pani Veronice S. Vigliotti a pani Jessice S. Vigliotti za darovanie ich mimoriadne cenného technického a profesionálneho času, ktorý im pomohol s dokončením tejto štúdie.

Konflikty záujmov

Autori vyhlasujú, že nemajú žiadny konflikt záujmov.

Referencie

[ 1 ]	Mach, H., Volkin, DB, Troutman, RD, Wang, B., Luo, Z., Jansen, KU a Shi, L. (2006) Demontáž a opätovná montáž rekombinantných častíc podobných vírusu ľudského papilomavírusu (HPV VLP) odvodených z kvasiniek. Journal of Pharmaceutical Sciences, 95, 2195-2206. doi:10.1002/jps.20696
[ 2 ]	Bryan, JT (2007) Vývoj vakcíny proti HPV na prevenciu rakoviny krčka maternice a genitálnych bradavíc. Vaccine, 25, 3001-3006. doi:10.1016/j.vaccine.2007.01.013
[ 3 ]	Študijná skupina Future II (2007) Štvorvalentná vakcína proti ľudskému papilomavírusu na prevenciu cervikálnych lézií vysokého stupňa. The New England Journal of Medicine, 356, 1915-1927. doi:10.1056/NEJMoa061741
[ 4 ]	Merck & Co., Inc. (2006) Gardasil? [Štvorvalentná rekombinantná vakcína proti ľudskému papilomavírusu typu 6, 11, 16, 18]. Dokument o produkte Merck 9883616. http://www.merck.com/product/usa/pi_circulars/g/gardasil/gardasil_pi.pdf
[ 5 ]	Einstein, MH, Baron, M., Levin, MJ, Chatterjee, A., Edwards, RP, Zepp, F., Carletti, I., Dessy, FJ, Trofa, AF, Schuind, A., Dubin, G. a študijná skupina HPV-010 (2009) Porovnanie imunogenicity a bezpečnosti vakcín proti ľudskému papilomavírusu (HPV) Cervarix a Gardasil u zdravých žien vo veku 18 – 45 rokov. Human Vaccines, 5, 705 – 719. doi:10.4161/hv.5.10.9518
[ 6 ]	Giuliano, AR, Lazcano-Ponce, E., Villa, L., Nolan, T., Marchant, C., Radley, D., Golm, G., McCarroll, K., Yu, J., Esser, MT, Vuocolo, SC a Barr, E. (2007) Vplyv východiskových kovariátov na imunogenicitu štvorvalentnej (typy 6, 11, 16 a 18) vakcíny proti ľudskému papilomavírusu s časticami podobnými vírusu. Journal of Infectious Diseases, 196, 1153-1162. doi:10.1086/521679
[ 7 ]	Villa, LL, Ault, KA, Giuliano, AR, Costa, RL, Petta, CA, Andrade, RP, Brown, DR, Ferenczy, A., Harper, DM, Koutsky, LA, Kurman, RJ, Lehtinen, M., Malm, C., Olsson, SE, Ronnett, BM, Skjeldestad, FE, Steinwall, M., Stoler, MH, Wheeler, CM, Taddeo, FJ, Yu, J., Lupinacci, L., Railkar, R., Marchese, R., Esser, MT, Bryan, J., Jansen, KU, Sings, HL, Tamms, GM, Saah, AJ a Barr, E. (2006) Imunologické odpovede po podaní vakcíny zameranej na ľudský papilomavírus.
[ 8 ]	Americký Úrad pre kontrolu potravín a liečiv (FDA). (2011) Informácie FDA o vakcíne Gardasil – očakáva sa prítomnosť fragmentov DNA, žiadne bezpečnostné riziko. http://www.fda.gov/BiologicsBloodVaccines/Vaccines/ApprovedProducts/ucm276859.htm
[ 9 ]	Lee, SH (2012) Detekcia DNA génu L1 ľudského papilomavírusu (HPV) pravdepodobne viazanej na časticové hliníkové adjuvans vo vakcíne proti HPV Gardasil?. Journal of Inorganic Biochemistry, 117, 85-92. doi:10.1016/j.jinorgbio.2012.08.015
[ 10 ]	Kwissa, M., Lindblad, EB, Schirmbeck, R. a Reimann, J. (2003) Spoločné podávanie DNA vakcíny a proteínovej vakcíny s fosforečnanom hlinitým stimuluje silnú a multivalentnú imunitnú odpoveď. Journal of Molecular Medicine, 81, 502-510. doi:10.1007/s00109-003-0452-9
[ 11 ]	Brotherton, JM, Gold, MS, Kemp, AS, McIntyre, PB, Burgess, MA, Campbell-Lloyd, S. a New South Wales Health HPV Adverse Events Panel (2008) Anafylaxia po štvorvalentnom očkovaní proti ľudskému papilomavírusu. Canadian Medical Association Journal, 179, 525-533. doi:10.1503/cmaj.080916
[ 12 ]	Sutton, I., Lahoria, R., Tan, I., Clouston, P. a Barnett, M. (2009) Demyelinizácia CNS a kvadrivalentná vakcinácia proti HPV. Časopis o skleróze multiple sclerosis, 15, 116-119. doi:10.1177/1352458508096868
[ 13 ]	Wildemann, B., Jarius, S., Hartmann, M., Regula, JU a Hametner, C. (2009) Akútna diseminovaná encefalomyelitída po očkovaní proti ľudskému papilomavírusu. Neurology, 72, 2132-2133. doi:10.1212/WNL.0b013e3181aa53bb
[ 14 ]	Mendoza Plasencia, Z., González López, M., Fernández Sanfiel, ML a Mu?iz Montes, JR (2010) Akútna diseminovaná encefalomyelitída s tumefaktívnymi léziami po očkovaní proti ľudskému papilomavírusu. Neurologia, 25, 58-59. doi:10.1016/S0213-4853(10)70023-2
[ 15 ]	Chang, J., Campagnolo, D., Vollmer, TL a Bomprezzi, R. (2011) Demyelinizačné ochorenie a polyvalentné očkovanie proti ľudskému papilomavírusu. Journal of Neurology, Neurosurgery, and Psychiatry, 82, 1296-1298. doi:10.1136/jnnp.2010.214924
[ 16 ]	DiMario Jr., FJ, Hajjar, M. a Ciesielski, T. (2010) 16-ročné dievča s bilaterálnou stratou zraku a ľavostrannou hemiparézou po očkovaní proti ľudskému papilomavírusu. Journal of Child Neurology, 25, 321-327. doi:10.1177/0883073809349322
[ 17 ]	Balamoutsos G, Bouktsi M, Paschalidou M, Tascos, N. a Milonas, I. (2009) Správa o piatich prípadoch demyelinizácie CNS po štvorvalentnom očkovaní proti ľudskému papilomavírusu: Mohla by medzi nimi existovať nejaká súvislosť? www.guthyjacksonfoundation.org/services/download.php?2297.pdf+374
[ 18 ]	Rossi, M., Bettini, C. a Pagano, C. (2011) Bilaterálny papilomavírusový edém po očkovaní proti ľudskému papilomavírusu. Journal of Medical Cases, 2, 222-224.
[ 19 ]	Slade, BA, Leidel, L., Vellozzi, C., Woo, EJ, Hua, W., Sutherland, A., Izurieta, HS, Ball, R., Miller, N., Braun, MM, Markowitz, LE a Iskander, J. (2009) Postlicencovaný bezpečnostný dohľad nad štvorvalentnou rekombinantnou vakcínou proti ľudskému papilomavírusu. The Journal of the American Medical Association, 302, 750-757. doi:10.1001/jama.2009.1201
[ 20 ]	Lee, SH, Vigliotti, VS, Vigliotti, JS a Pappu, S. (2007) Rutinná genotypizácia ľudského papilomavírusu sekvenovaním DNA v laboratóriách komunitných nemocníc. Infectious Agents and Cancer, 2, 11. doi:10.1186/1750-9378-2-11
[ 21 ]	Lee, SH, Vigliotti, VS a Pappu, S. (2009) Infekcia ľudským papilomavírusom (HPV) u žien v reprezentatívnej vidieckej a prímestskej populácii Spojených štátov. International Journal of Gynecology & Obstetrics, 105, 210-214. doi:10.1016/j.ijgo.2009.01.019
[ 22 ]	Lee, SH, Vigliotti, VS a Pappu, S. (2009) Molekulárne testy na ľudský papilomavírus (HPV), Chlamydia trachomatis a Neisseria gonorrhoeae v tekutej cytologickej vzorke. BMC Women’s Health, 9, 8. doi:10.1186/1472-6874-9-8
[ 23 ]	Lee, SH, Vigliotti, VS, Vigliotti, JS a Pappu, S. (2009) Validácia genotypizácie ľudského papilomavírusu analýzou sekvencie podpisovej DNA. BMC Clinical Pathology, 9, 3. doi:10.1186/1472-6890-9-3
[ 24 ]	Lee, SH, Vigliotti, VS a Pappu, S. (2010) Validácia podpisovej sekvencie ľudského papilomavírusu typu 16 (HPV-16) v klinických vzorkách. Journal of Clinical Pathology, 63, 235-239. doi:10.1136/jcp.2009.069401
[ 25 ]	Lee, SH (2012) Pokyny pre používanie molekulárnych testov na detekciu a genotypizáciu ľudského papilomavírusu z klinických vzoriek. Methods in Molecular Biology, 903, 65-101. doi:10.1007/978-1-61779-937-2_5
[ 26 ]	Lee, SH (2013) Topologické konformačné zmeny DNA ľudského papilomavírusu (HPV) viazanej na nerozpustnú hliníkovú soľ – štúdia pomocou PCR pri nízkej teplote. Advances in Biological Chemistry, v tlači.
[ 27 ]	Karlik, SJ, Eichhorn, GL, Lewis, PN a Crapper, DR (1980) Interakcia hliníkových zlúčenín s deoxyribonukleovou kyselinou. Biochemistry, 19, 5991-5998. doi:10.1021/bi00567a008
[ 28 ]	Schubbert, R., Renz, D., Schmitz, B. a Doerfler, W. (1997) Cudzia (M13) DNA požitá myšami sa cez sliznicu črevnej steny dostáva do periférnych leukocytov, sleziny a pečene a môže byť kovalentne viazaná na myšaciu DNA. Zborník Národnej akadémie vied Spojených štátov, 94, 961-966. doi:10.1073/pnas.94.3.961
[ 29 ]	Shimada, T., Yamaguchi, N., Nishida, N., Yamasaki, K., Miura, K., Katamine, S. a Masuzaki, H. (2010) DNA ľudského papilomavírusu v plazme pacientok s rakovinou krčka maternice s pozitívnym testom na HPV16. Japanese Journal of Clinical Oncology, 40, 420-424. doi:10.1093/jjco/hyp193
[ 30 ]	Bodaghi, S., Wood, LV, Roby, G., Ryder, C., Steinberg, SM a Zheng, ZM (2005) Môžu sa ľudské papilomavírusy šíriť krvou? Journal of Clinical Microbiology, 43, 5428-5434. doi:10.1128/JCM.43.11.5428-5434.2005
[ 31 ]	Marichal, T., Ohata, K., Bedoret, D., Mesnil, C., Sabatel, C., Kobiyama, K., Lekeux, P., Coban, C., Akira, S., Ishii, KJ, Bureau, F. a Desmet, CJ (2011) DNA uvoľnená z umierajúcich hostiteľských buniek sprostredkuje adjuvanciu hliníka. Nature Medicine, 17, 996-991. doi: 10,1038/nm.2403
[ 32 ]	Gherardi, RK, Coquet, M., Cherin, P., Belec, L., Moretto, P., Dreyfus, PA, Pellissier, JF, Chariot, P. a Authier FJ. (2001) Makrofágové lézie myofasciitídy hodnotia dlhodobú perzistenciu hydroxidu hlinitého získaného z vakcíny vo svaloch. Brain, 124, 1821-1831. doi:10.1093/brain/124.9.1821
[ 33 ]	Exley, C., Swarbrick, L., Gherardi, RK a Authier, FJ (2009) Úloha hliníka v telesnom zaťažení pri makrofágovej myofasciitíde a syndróme chronickej únavy spojenej s očkovaním. Medical Hypotheses, 72, 135-139. doi:10.1016/j.mehy.2008.09.040
[ 34 ]	Gherardi, RK a Authier, FJ (2012) Makrofágna myofasciitída: Charakterizácia a patofyziológia. Lupus, 21, 184-189. doi:10.1177/0961203311429557
[ 35 ]	Caulfield, MJ, Shi, L., Wang, S., Wang, B., Tobery, TW, Mach, H., Ahl, PL, Cannon, JL, Cook, JC, Heinrichs, JH a Sitrin, RD (2007) Vplyv alternatívnych hliníkových adjuvancií na absorpciu a imunogenicitu VLP HPV16 L1 u myší. Human Vaccines, 3, 139-145. doi:10.4161/hv.3.4.4309
[ 36 ]	Würtele, H., Little, KC a Chartrand, P. (2003) Nelegitímna integrácia DNA v bunkách cicavcov. Gene Therapy, 10, 1791-1799. doi:10.1038/sj.gt.3302074
[ 37 ]	Milot, E., Belmaaza, A., Wallenburg, JC, Gusew, N., Bradley, WE a Chartrand, P. (1992) Nelegitímna rekombinácia chromozómov v bunkách cicavcov je spojená s vnútorne ohnutými prvkami DNA. European Molecular Biology Organization Journal, 11, 5063-5070.
[ 38 ]	Doerfler, W., Schubbert, R., Heller, H., Kömmer, C., Hilger-Eversheim, K., Knoblauch, M. a Remus, R. (1997) Integrácia cudzej DNA a jej dôsledky v cicavčích systémoch. Trends in Biotechnology, 15, 297-301. doi:10.1016/S0167-7799(97)01061-5
[ 39 ]	Bergen, JM, Park, IK, Horner, PJ a Pun, SH (2008) Nevírusové prístupy k neurónovému dodávaniu nukleových kyselín. Pharmaceutical Research, 25, 983-998. doi:10.1007/s11095-007-9439-5
[ 40 ]	Lechardeur, D., Verkman, AS a Lukacs, GL (2005) Intracelulárne smerovanie plazmidovej DNA počas nevírusového prenosu génov. Advanced Drug Delivery Reviews, 57, 755-767. doi:10.1016/j.addr.2004.12.008
[ 41 ]	Sparwasser, T., Miethke, T., Lipford, G., Erdmann, A., Höcker, H., Heeg, K. a Wagner, H. (1997) Makrofágy vnímajú patogény prostredníctvom DNA motívov: indukcia šoku sprostredkovaného tumor nekrotizujúcim faktorom alfa. European Journal of Immunology, 27, 1671-1679. doi:10.1002/eji.1830270712
[ 42 ]	Höcker, H., Mischak, H., Miethke, T., Liptay, S., Schmid, R., Sparwasser, T., Heeg, K., Lipford, GB, Wagner, H. (1998) CpG-DNA-špecifická aktivácia antigén prezentujúcich buniek vyžaduje aktivitu stresovej kinázy a predchádza jej nešpecifická endocytóza a endozomálne dozrievanie. European Molecular Biology Organization Journal, 17, 6230-6240.
[ 43 ]	Höcker, G., Redecke, V. a Höcker, H. (2002) Aktivácia imunitného systému bakteriálnou CpG-DNA. Imunológia, 105, 245-251.
[ 44 ]	Yoshida, H., Nishikawa, M., Yasuda, S., Mizuno, Y. a Takakura, Y. (2008) Bunková aktivácia plazmidovou DNA v rôznych makrofágoch v primárnej kultúre. Journal of Pharmaceutical Sciences, 97, 4575-4585. doi:10.1002/jps.21302
[ 45 ]	Boccaccio, GL, Mor, F. a Steinman, L. (1999) Nekódujúca plazmidová DNA indukuje IFN-gama in vivo a potláča autoimunitnú encefalomyelitídu. International Immunology, 11, 289-296. doi:10.1093/intimm/11.2.289
[ 46 ]	Fukuhara, Y., Naoi, T., Ogawa, Y., Nishikawa, M. a Takakura, Y. (2007) Príjem plazmidovej DNA a následné charakteristiky bunkovej aktivácie v bunkách odvodených z ľudských monocytov v primárnej kultúre. Journal of Pharmaceutical Sciences, 96, 1576-1584. doi:10.1002/jps.20816
[ 47 ]	Parrillo, JE, Burch, C., Shelhamer, JH, Parker, MM, Natanson, C. a Schuette, W. (1985) Cirkulujúca látka tlmiaca myokardiálny tlak u ľudí so septickým šokom. Pacienti so septickým šokom so zníženou ejekčnou frakciou majú cirkulujúci faktor, ktorý in vitro znižuje výkonnosť myokardiálnych buniek. Journal of Clinical Investigation, 76, 1539-1553. doi:10.1172/JCI112135
[ 48 ]	Kumar, A., Paladugu, B., Mensing, J., Kumar, A. a Parrillo, JE (2007) Mechanizmy závislé a nezávislé od oxidu dusnatého sú zapojené do depresie kontraktility srdcových myocytov vyvolanej TNF-alfa. American Journal of Physiology—Regulatory, Integrative, and Comparative Physiology, 292, R1900-R1906. doi:10.1152/ajpregu.00146.2006
[ 49 ]	Cauwels, A., Van Molle, W., Janssen, B., Everaerdt, B., Huang, P., Fiers, W. a Brouckaert, P. (2000) Ochrana pred letálnym šokom vyvolaným TNF inhibíciou rozpustnej guanylátcyklázy vyžaduje funkčnú indukovateľnú syntázu oxidu dusnatého. Immunity, 13, 223-231. doi:10.1016/S1074-7613(00)00022-4
[ 50 ]	Cauwels, A. a Brouckaert, P. (2007) Prežitie pri toxicite TNF: Závislosť od kaspáz a NO. Archives of Biochemistry and Biophysics, 462, 132-139. doi:10.1016/j.abb.2007.01.021
[ 51 ]	Cauwels, A., Janssen, B., Waeytens, A., Cuvelier, C. a Brouckaert, P. (2003) Inhibícia kaspázy spôsobuje hyperakútny šok vyvolaný faktorom nekrózy nádorov prostredníctvom oxidačného stresu a fosfolipázy A2. Nature Immunology, 4, 387-493. doi:10.1038/ni914
[ 52 ]	Weinberg, JR, Wright, DJ a Guz, A. (1988) Interleukín-1 a faktor nekrózy nádorov spôsobujú hypotenziu u bdelého králika. Clinical science (Londýn), 75, 251-255.
[ 53 ]	Turner, CR, Esser, KM, Wheeldon, EB, Slivjak, M. a Smith, EF III (1989) Kardiovaskulárne a pľúcne účinky ľudského rekombinantného tumor nekrotizujúceho faktora u bdelých potkanov. Circulatory Shock, 28, 369-384.
[ 54 ]	Chapman, PB, Lester, TJ, Casper, ES, Gabrilove, JL, Wong, GY, Kempin, SJ, Gold, PJ, Welt, S., Warren, RS, Starnes, HF, Sherwin, SA, Old, LJ a Oettgen, HF (1987) Klinická farmakológia rekombinantného ľudského tumor nekrotizujúceho faktora u pacientov s pokročilým karcinómom. Journal of Clinical Oncology, 5, 1942-1951.
[ 55 ]	Brouckaert, P., Ameloot, P., Cauwels, A., Everaerdt, B., Libert, C., Takahashi, N., Van Molle, W. a Fiers, W. (1994) Receptorovo selektívne mutanty faktora nekrózy nádorov v terapii rakoviny: Predklinické štúdie. Circulatory Shock, 43, 185-190.

Podobné a súvisiace

Discover more from Vynášam na svetlo to, čo iní zatajujú

Subscribe to get the latest posts sent to your email.

Po 20 rokoch reklamy sa vakcína proti HPV teraz prehodnocuje.